Het thema van de decembereditie is dit keer opnieuw de therapeutische toepassing van bacteriofagen. In de editie van september werden onder gastredacteurschap van Marc Bonten al enkele artikelen opgenomen. Dit keer een vervolg daarop met deel 2 en 3 van de overzichten van Julia Egido Egido over de resistentiemechanismen van fagen. In Nederland is faagtherapie enkele keren toegepast, maar nog zelden beschreven. In 2018 werd in het Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde door Van der Meer en Vandenbroucke-Grauls een oproep gedaan tot het voeren van klinische studies over het toepassen van faagtherapie bij multiresistente infecties.[1] Daar is tot op heden nog geen zicht op. Saskia Kuipers beschrijft voor dit thema casuïstieken van twee met fagen behandelde patiënten, waarbij de productie van de gebruikte fagen niet in ons land heeft plaatsgevonden.
In 1918, ten tijde van de desastreus huishoudende griep, was de aard van de verwekker niet bekend. Commentaren van wetenschappers uit die tijd zijn in oude kranten opvallend afwezig. In de jaren 80, toen de opkomst van het acquired immune deficiency syndrome stap voor stap duidelijk werd, was de aandacht van wetenschappers wisselend van intensiteit over het beloop van een aantal jaren naar gelang er meer bekend werd over de virale oorsprong. In het afgelopen jaar is de feitenstroom rond het nieuwe coronavirus op alle facetten van ons vak zo overweldigend dat vakbladen zich wereldwijd intensief bezighouden met Covid-19. Het jaar is nog niet ten einde en er wordt nog steeds geschiedenis geschreven; we maken in het staartje van dit jaar de meest restrictieve maatregelen tot nu toe mee. Op dit moment kan al worden vastgesteld dat er niet veel jaren zijn waarin, met de tientallen optredens van collega’s in de media, de microbiologie zo in de belangstelling heeft gestaan als in 2020.
In deze editie is opnieuw plaats ingeruimd voor drie eerder digitaal gepubliceerde artikelen over Covid-19. Het eerste artikel is van Hazenberg, die de ontwikkeling beschrijft van een datasysteem rond de registratie van testresultaten. In het tweede artikel schrijft Mulder over de associatie tussen doorgemaakte Q-koorts en ernstige ziekte of sterfte bij Covid-19-patiënten. Niet alleen de geografische overlap tussen de Q-koortsepidemie en de eerste golf van Covid-19 is interessant. Inmiddels wordt ook steeds duidelijker dat, net als chronische Q-koorts, een deel van de Covid-19-patiënten langdurige klachten laat zien die geduid worden als ‘long Covid’. In een derde Covid-19-artikel van Heron en anderen worden de bevindingen van onderzoek van de cellulaire afweer bij Covid-19 gepresenteerd.
Hoewel je het na dit heftige coronajaar bijna zou vergeten, plaatsen we in dit nummer traditiegetrouw van de groep van Fouchier de jaarlijkse beschrijving van de griepepidemie 2019-2020. Op het zuidelijk halfrond is afgelopen zomerperiode gelukkig weinig griepactiviteit waargenomen, waarschijnlijk in samenhang met de coronamaatregelen. Laten we hopen dat de komende kerst- en nieuwjaarsperiode net zo min een sterke opleving van griepactiviteit laat zien als een opleving van het SARS-CoV-2, door sommigen al betiteld als dreigende derde golf.
Het lonkend perspectief voor 2021 is dat er een aantal doorbraken te melden is. Ten eerste zullen er in de loop van 2021 diverse coronavaccins beschikbaar komen. In afwachting van de komst van vaccins bieden daarnaast de sneltesten de mogelijkheid van laagdrempelig testen bij instellingen, op scholen, in de horeca, bij culturele activiteiten en sportwedstrijden. Daarmee moet 2021 na de tweede golf en de lockdown, een veel beter jaar dan 2020 gaan worden.
De redactie wenst alle lezers rustige kerstdagen, een goede jaarwisseling en het allerbeste voor 2021 toe.

Namens de redactie,
Bert Mulder, Esther Heikens, Jan Kaan
1. Ned Tijdschr Geneeskd. 2018;162:D2433

Feuilleton in vijf delen
In vijf delen (in achtereenvolgende uitgaven van het NTMM) worden de huidige kennis van bacteriofaagresistentie, de genetische oorzaak die daarvoor verantwoordelijk is en de manier waarop fagen de tegenaanval inzetten, besproken. Na het eerste deel van in totaal vijf delen in de vorige editie volgen hier en tweede en derde hoofdstuk. In deel 2 wordt aandacht gegeven aan de bacteriële resistentiemechanismen die een faag moet overwinnen. Deel drie is aansluitend in deze editie opgenomen.

Resistentiemechanismen
Het tweede van de vijf delen over faagtherapie gaat over de resistentiemechanismen waarover de bacterie beschikt om zich te beschermen tegen een faag.
Om faagtherapie te laten slagen, moet rekening gehouden worden met de resistentieontwikkeling door de bacterie. In een overzichtsartikel publiceerde Oeschlin in 2018 een uitgebreid overzicht waarin de uitkomst van verschillende casus beschreven worden met faagtherapie zowel binnen de veehouderij als in een klinische setting.[1] Hierin laat hij zien dat in de meeste onderzoeken bij zoogdieren de resistente populaties al vaak binnen uren na de eerste gift fagen worden waargenomen. De exacte mechanismen die hieraan ten grondslag liggen, worden echter zelden onderzocht in deze experimenten.

Blokkeren van adsorptie
De verschillende bacteriële verdedigingsmechanismen kunnen zich richten op vrijwel elke stap binnen de infectiecyclus van de bacteriofaag.[2] De eerste barrière die bacteriën kunnen opwerpen is het blokkeren de van voor de faag noodzakelijke receptoren. Door het produceren van extracellulaire matrix ontstaat een fysieke barrière die de oppervlaktereceptoren verbergen. Ook beschermen extracellulaire polymeren zoals alginaat en hyaluronzuur bacteriën tegen vijandige omgevingscondities; zij fungeren als virulentiefactor en spelen een rol bij het vormen van biofilms.[3]
Een andere manier om het aanhechten van fagen te blokkeren, is het produceren van eiwitten die de receptoren blokkeren of maskeren. Een voorbeeld is het eiwit TraT; dit gaat een interactie aan met de OmpA-receptor in Escherichia coli waarmee deze ontoegankelijk wordt voor bepaalde fagen.[4] Fagen kunnen zelf ook eiwitten produceren waarmee receptoren geblokkeerd worden. Hiermee worden aanvullende infecties met dezelfde of nauw gerelateerde faagsoorten voorkomen. Dit fenomeen wordt superinfection exclusion (Sie) genoemd. Het Sie-mechanisme voorkomt tevens de inactivatie van nieuwe viruspartikels door binding aan receptoren van bacterieresten vroeg na de lysis. Dit mechanisme werd waargenomen in faag T5. Deze faag produceert het lipoproteïne Llp dat zijn eigen receptoren blokkeert.[5] Ook bacteriën onder stress kunnen dergelijke maskerende moleculen produceren.[6]
Een ander verdedigingsmechanisme van bacteriën is het produceren van buitenmembraanvesikels die fungeren als lokaas, waardoor een deel van de omringende fagen wordt weggevangen.[7]
De expressie van faagreceptoren wordt vaak gereguleerd door genetische modulatoren die betrokken zijn bij fasevariatie. Fasevariatie is een soort aan-uitmechanisme waarmee bacteriën hun fenotype kunnen aanpassen aan bepaalde omgevingsomstandigheden. Dit proces wordt met name gezien als een manier om het immuunsysteem van de gastheer te vermijden, maar blijkt ook een rol te spelen bij het ontwijken van infecties door fagen.[8] Zo kan de expressie van bepaalde oppervlaktereceptoren worden verminderd door fasevariatie. Ook kunnen receptoren van samenstelling veranderen door verschillende voorgeprogrammeerde mutaties. Sommige fasespecifieke moleculen zijn tevens betrokken bij de bacteriële pathogenese, zoals virulentiefactoren, adhesinen en toxinen.[9] Fasevariatie als reactie op blootstelling aan fagen kan hierdoor resulteren in een verandering in virulentie van de bacterie. Dit zou betekenen dat bacteriën gevoeliger kunnen worden voor de werking van het humane immuunsysteem of voor bepaalde antibiotica. Virulentie kan echter ook toenemen als gevolg van fasevariatie. Het is belangrijk deze mogelijke effecten van bacteriofagen in beschouwing te nemen bij het ontwikkelen van faagtherapie. De onderliggende genetische mechanismen worden later in dit overzicht besproken.

Obstructie van toegang tot het bacteriële DNA
De tweede stap in het infectieproces van de faag waar verdedigingsmechanismen op inspelen, is de toegang tot het cytoplasma.[2] Fagen degraderen hiervoor de peptidoglycaanlaag van de celwand; in het geval van gramnegatieve bacteriën zal het DNA ook het buitenmembraan moeten passeren. Hierna zal het DNA moeten worden getransloceerd door het binnenmembraan naar het cytoplasma. Deze stappen kunnen worden geblokkeerd door membraangeassocieerde eiwitten. Deze worden meestal gecodeerd door profaag-DNA. Dit is ook een voorbeeld van de rol van het Sie-systeem. Het obstruerende effect van deze membraangeassocieerde eiwitten berust op het remmen van de formatie van het kanaal waar het DNA doorheen migreert, het inhiberen van het faaglysosym dat de peptidoglycaanlaag degradeert of het voorkómen van translocatie door het veranderen van de conformatie van de eiwitten rondom de plaats van ejectie.[10]

Degradatie van DNA: restrictie-modificatiesystemen
Als het faag-DNA eenmaal de gastheercel binnengedrongen is, zal het een van de meest beschreven bacteriële verdedigingsmechanismen tegenkomen: het restrictie-modificatie (R-M)-systeem. Dit werkingsmechanisme is gebaseerd op de het gecombineerde effect van methyltransferase en een restrictie-enzym.[11] Methyltransferase methyleert endogeen DNA op specifieke plekken, hetgeen voorkómt dat het DNA gesplitst wordt door een restrictie-enzym. Methyltransferases herkennen vaak hemigemethyleerd DNA, dit is het product van de replicatie van gemethyleerd DNA. Restrictie-enzymen herkennen daarentegen vreemd, ongewijzigd DNA en splitsen dit op specifieke locaties. Meestal zijn dit vier tot acht baseparen-lange palindromische sequenties. Het evenwicht tussen de activiteit van deze twee enzymen bepaalt het lot van het binnenkomende faag-DNA. Restrictie-enzymen hebben veelal een hogere verwerkingssnelheid dan methyltransferases. Maar als het faag-DNA gemethyleerd wordt voordat het restrictie-enzym het kan splitsen, kan het naburige cellen infecteren. Interessant is dat methyltransferases over het algemeen meer geconserveerd zijn dan restrictie-enzymen, die sneller evolueren om de mutaties in het faaggenoom bij te houden.[12] R-M-systemen worden daarom in de basenvolgorde van bacteriële genomen meestal geïdentificeerd door de genen die overeenkomen met methyltransferases.[12]
Er zijn vier klassieke typen van R-M systemen.[11] Het type II-systeem komt het meest voor en bestaat uit een methyltransferase en een restrictie-enzym, die onafhankelijk van elkaar werkzaam zijn als twee aparte eiwitten.
De kennis over R-M-gerelateerde systemen blijft groeien naarmate er meer bekend wordt over bacteriële genomen. Een voorbeeld hiervan is het verdedigingssysteem DISARM (‘defence island system associated with restriction–modification’), dat geassocieerd wordt met restrictie-modificatie.[13] Dit systeem bevat ook een methyltransferase en een restrictiemodule. Deze restrictiemodule werkt echter anders dan de restrictie-enzymen en is afhankelijk van het samenspel van meerdere componenten. Het precieze werkingsmechanisme wordt nog niet volledig begrepen. Hoewel de faagadsorptie niet geblokkeerd wordt, voorkomt het circularisatie (tot cirkelvorm sluiten door verbinding van beide DNA-uiteinden) van faag-DNA waardoor DNA-replicatie en lysogenie in een vroeg stadium van de infectie worden voorkomen. Vermoed wordt dat DISARM tevens samenwerkt met verschillende R-M-elementen waardoor er een synergistisch effect optreedt tegen faaginfectie.
Faagexclusie (BacteRiophage EXclusion BREX) is een ander verdedigingsmechanisme dat zich richt op het faag-DNA zodra het de gastheercel is binnengedrongen.[14] Ook dit systeem methyleert het gastheereigen DNA om dit te kunnen onderscheiden van exogeen DNA. Het BREX-systeem breekt het niet-gemethyleerde DNA echter niet af, in tegenstelling tot R-M-systemen. Analyse van DNA dat geëxtraheerd is uit door fagen geïnfecteerde bacteriën die BREX tot expressie brengen, wees erop dat BREX replicatie belemmert zonder het faag-DNA te splitsen of te verwerken.[14] Bijzonder aan dit systeem is dat de activiteit van de methylase nodig lijkt te zijn om resistentie te vormen tegen bacteriofagen. Daarnaast is bekend dat gemethyleerd of geglycosyleerd faag-DNA niet gevoelig is voor BREX.[15] In sommige bacteriën wordt vreemd DNA onderschept door eiwitten van de Argonaute (Ago)-familie. Deze eiwitten zijn ook aanwezig in eukaryote cellen. Daar reguleren zij de afbraak van exogeen RNA met behulp van interferentie-RNA’s (small interfering RNA’s, siRNA’s) die het doel herkennen. Hoewel dit proces in prokaryote cellen minder goed is bestudeerd, zijn er prokaryotische Ago-eiwitten (pAgo) gevonden in Thermus thermophilus (TtAgo) en in Rhodobacter sphaeroides (RsAgo). Bij TtAgo berust dit mechanisme op DNA-DNA-interferentie in plaats van RNA-RNA-interferentie in tegenstelling tot eukaryoot Ago.[16] Het TtAgo-proteïne heeft tevens een endonucleasedomein dat zowel enkelstrengs-DNA als negatief supercoiled dubbelstrengs-DNA (circulair DNA met een tertiaire winding, dat zich meestal in plasmiden bevindt) kan splijten. Hoewel het onduidelijk is hoe het interferentie-RNA of -DNA wordt gevormd, lijkt de activiteit van het Ago-eiwit zelf nodig te zijn voor de productie hiervan. In tegenstelling tot TtAgo maakt RsAgo gebruik van kleine RNA-moleculen om vreemd DNA te herkennen.[17] RsAgo heeft geen endonucleasedomein, DNA-interferentie wordt in dit geval veroorzaakt door enkel de binding aan het target.

Adaptieve immuniteit: CRISPR-Cas
Een ander mechanisme waarmee bacteriën faag-DNA kunnen degraderen, is met behulp van het CRISPR-Cassysteem (CRISPR staat voor: ‘Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats’; Cas staat voor ‘CRISPR Associated Proteins’). Het CRISPR-Casmechanisme is tot nu toe de enige vorm van adaptieve immuniteit die is beschreven in bacteriën. Ze worden verdeeld in zes typen,[18] waarvan type II de bekendste is door de toepassing binnen de biotechnologie.[19]
Na infectie door een faag of plasmide kan de bacterie het vreemd DNA afbreken in kleine fragmenten die als interspacers in de CRISPR-reeks worden geplaatst. De CRISPR-regio van het genoom bestaat uit repetitieve sequenties die worden gescheiden door deze interspacers.[20] Dit creëert een immunologisch geheugen dat het bacteriën mogelijk maakt om vreemd DNA te detecteren na een eerdere infectie. De CRISPR-regio wordt getranscribeerd waarmee korte RNA-fragmenten worden gevormd, zogenaamde CRISPR-RNA’s (crRNA’s). Elk crRNA-fragment koppelt zich aan een Cas-eiwit en leidt het naar het binnengedrongen DNA. Caseiwitten hebben een endonucleasefunctie en splijten daarmee het vreemd DNA op een sequentiespecifieke manier. Type I en type Y CRISPR/Cas-systemen herkennen daarnaast ook een geconserveerde sequentie van drie nucleotiden naast de plek waar het DNA gesplitst is, het ‘protospacer adjacent motif’ (PAM).[21]

Abortieve infectie
Als al deze verdedigingsmechanismen falen en de bacterie irreversibel is geïnfecteerd door een bacteriofaag, kan de geïnfecteerde bacterie zich opofferen om de rest van de populatie te beschermen. Verantwoordelijk hiervoor zijn de ‘abortieve infectiesystemen’. Veel van deze systemen bestaan uit een toxine-antitoxinemechanisme en zijn afhankelijk van de balans tussen een stabiel toxine en een onstabiel antitoxine.[22]
Infectie van de gastheercel door een faag onderdrukt de productie van antitoxine. Het gevolg hiervan is dat het toxine de overhand krijgt, waardoor de bacterie sterft en er geen nieuwe fagen gegenereerd kunnen worden.
Er zijn verschillende soorten abortieve infectiemechanismen, zoals het RexA-RexB-systeem,[23] het ‘Lit’-systeem, het ‘PrrC’-systeem,[24] exclusie van T7 door PifA[25] en de faag-DNA-replicatie, zoals bijvoorbeeld gezien in Lactoccoccus-speciës.[26]

In het derde deel van dit feuilleton gaan we dieper in op de genetische mechanismen van faagresistentie.

De enorme complexiteit in prokaryotische genomen verklaart de vele verschillende manieren waarop bacteriën zich kunnen aanpassen en resistentie tegen een faaginfectie kunnen ontwikkelen (figuur 1). Bacteriën kunnen zich in een zeer snel tempo delen en zijn aan een constante selectiedruk onderhevig. Zo kunnen mutaties zich in hoog tempo in een bacteriepopulatie verspreiden. Dat fagen een mutageen effect kunnen hebben op bacteriën is al sinds 1963 bekend.[1]

Profagen en plasmiden
Veranderingen in het bacterieel genoom vinden vaak niet willekeurig verspreid plaats. Veel van de in deel twee beschreven resistentiemechanismen worden gecodeerd door genen die geclusterd zijn in zogenoemde ‘defence islands’.[2] In deze geclusterde regio’s is sprake van geprogrammeerde genetische variatie, die de diversiteit van het genoom sneller en efficiënter kan verhogen dan willekeurig voorkomende puntmutaties.
Deze defence islands kunnen worden gereguleerd door mobiele of flexibele genetische elementen. Deze elementen worden wel beschreven als bacterieel mobiloom. De belangrijkste bron voor verrijking van het mobiloom zijn gematigde fagen.[3] Deze elementen kunnen worden overgenomen door volgende generaties of, in het geval van plasmiden, horizontaal worden overgedragen door middel van conjugatie. Deze geïntegreerde elementen kunnen gunstige eigenschappen bevatten die oorspronkelijk ontwikkeld zijn voor faag-faaginteractie.
Homotypische competitie, oftewel competitie tussen fagen van dezelfde of een nauw verwante soort, is een veelvoorkomend fenomeen. Veel profagen coderen voor repressorgenen, Sie-systemen of restrictie-modificatiemechanismen die zich richten op hun eigen of een nauw verwante soort.[4] Op deze manier wordt het aantal vrije fagen, dat andere bacteriën kan koloniseren, vergroot. Competitie tussen verschillende faagsoorten komt veel voor.[5]
Ook plasmiden kunnen verantwoordelijk zijn voor faagresistentie hoewel ze met name uitgebreid beschreven zijn in relatie tot antibioticumresistentie. Vooral in de voedingsmiddelenindustrie is onderzoek gedaan naar plasmide-gemedieerde faagresistentie voor de bescherming van bacteriestammen die gebruikt worden voor de productie van onder andere zuivelproducten. Dit soort plasmiden zijn beschreven in Lactococcus lactis.[6-9]
Plasmiden kunnen daarnaast genetische variaties aanbrengen in het bacteriële genoom door te coderen voor geclusterde inversiegebieden oftewel ‘shufflons’.[10] Deze systemen worden maar in enkele bacteriën beschreven. Ze werden voor het eerst gevonden in het plasmide R64 van de Salmonella spp. Ze bestaan uit verschillende recombinatiesequenties en een recombinase, Rci, die een inversie of deletie van het tussenliggende DNA teweeg kan brengen. Zo kan geschakeld worden tussen de aan- of afwezigheid van oppervlaktestructuren, zoals pili, die door fagen herkend kunnen worden.[11-12]

Bacteriële fasevariatie
Zoals boven beschreven kan door fasevariatie faaginfectie vermeden worden. Er zijn drie mechanismen die hieraan ten grondslag liggen: locatiespecifieke recombinatie, slipped-strand mispairing en epigenetische modificatie.[13] Locatiespecifieke recombinatie vindt plaats op een specifieke plek binnen een korte recombinatiereeks en wordt gemedieerd door een specifiek recombinase.[14] Door inversie van een DNA-segment in het regulatiegebied kan de expressie van een gen worden in- of uitgeschakeld. In sommige gevallen zijn recombinasen in staat om deze inversie de andere kant op te katalyseren, in andere gevallen is hier een ander enzym voor nodig. De aan- of afwezigheid van oppervlaktestructuren van een bacterie is een van de eigenschappen die kunnen worden gereguleerd door dit mechanisme. Dit gebeurt bijvoorbeeld bij de ontwikkeling van flagellen in Salmonella spp en fimbriae in E. coli.[15-17]
Ook slipped strand mispairing vindt plaats in specifieke regio’s, maar deze regio’s bestaan juist uit korte herhalende DNA-segmenten.[18] Slipped strand mispairing is een mutatieproces dat optreedt in specifieke regio’s tijdens DNA-recombinatie, waarbij de verkeerde complementaire basen tegenover elkaar komen te liggen. De regio’s waarin dit optreedt bestaan uit korte herhalingen van een bepaalde sequentie.[18] Deze mutaties kunnen stroomopwaarts van het gen of binnen de coderende sequentie optreden.[19] Slipped strand mispairing kan leiden tot veranderde expressie van een gen of ook tot verandering in het genproduct zelf.[20] Als gevolg daarvan kan slipped-strand mispairing aanleiding zijn voor faagresistentie door onder meer de non-expressie van receptoren [21-22] of R-M-systemen.[23]
Epigenetische modificaties zijn voornamelijk gebaseerd op veranderingen in methyleringspatronen op DNA-sequenties.[24] In bacteriën is methylering van adenine het meest voorkomend en dit wordt gekatalyseerd door het enzym Dam (DNA-adenine-methylase). Methylering door Dam kan een rol spelen bij de onderdrukking van bepaalde promotors.[25] Zo reguleert methylering door Dam het verkorten van O-antigeenketens in de lipopolysacharide van Salmonella enterica.[26] Dit maakt de bacterie resistent tegen fagen maar het gaat ten koste van de eigenschap zich te kunnen prolifereren binnen macrofagen, wat de bacterie minder virulent maakt.

Transponeerbare elementen
Ook transponeerbare elementen dragen bij aan de genetische variabiliteit, oftewel transposons. Transposons zijn DNA-fragmenten die hun positie binnen het genoom willekeurig kunnen veranderen. Dit creëert mutaties en in sommige gevallen veranderingen in de grootte van het genoom. Transposons kunnen tussen bacteriesoorten worden overgedragen door middel van fagen.[27] Transpositie van DNA-sequenties stimuleert mutagenese hetgeen de kans op de ontwikkeling van een faagresistent fenotype vergroot.
Een bijzonder voorbeeld van transpositie van bacteriën wordt gezien bij de bacteriofaag Mu. Het genoom van deze faag kan fungeren als een transposon en op willekeurige posities van het bacteriële genoom worden geplaatst. Op deze manier kunnen genen of operons worden verstoord en stimuleert het de mutatiefrequentie.[28] Het genoom kan zijn DNA inbrengen in elke willekeurige fase van de levenscyclus van de bacterie waarbij het meer dan één keer kan worden getransposeerd.[29]
Anderzijds kunnen transposons ook een technisch hulpmiddel zijn om genen die betrokken zijn bij faagresistentie te identificeren. Hierbij worden aselect gekozen transposons in vitro gebruikt om bacteriële mutanten te selecteren. In deze faagresistente mutanten wordt de insertieplek geïdentificeerd door sequensen om zo het mechanisme van faagresistentie op te helderen.[30]

Faag-induceerbare chromosomale eilanden
Sommige grampositieve bacteriën hebben een nog slimmere manier waarmee ze hun genoom gebruiken als bescherming tegen faaginfectie. Ze coderen voor zogeheten faag-induceerbare chromosomale eilanden (PICI’s). Dit zijn als het ware genetische parasieten die kunnen concurreren met binnengevallen fagen tijdens hun lytische cyclus. De meest bekende zijn de PICI’s die gevonden zijn in Staphylococcus aureus, de SaPI’s.[31] SaPI’s worden tot expressie gebracht als reactie op een faaginfectie. Ze kunnen zich repliceren en verpakken zich binnenin de capside van de infecterende faag, waarmee het genoom van de faag zelf wordt verdreven. De nieuw gevormde SaPI-dragende virions barsten vervolgens uit de cel bij de lysis en verspreiden zich naar nabijgelegen bacteriën waar ze concurreren met faaginfectie.

In deel vier gaan we verder in op de mechanismen waarop bacteriofagen de tegenaanval inzetten.

Achtergrond
Bacteriofagen, ook wel de meest voorkomende microben op deze aardbol genoemd en vast onderdeel van het menselijk microbioom, zijn behoorlijk in het nieuws geweest de afgelopen jaren. De sterke toename van antibioticumresistentie sinds 2000 is hier mede debet aan. In de jaren vijftig van de vorige eeuw waren antibiotica volop beschikbaar in Europa en de Verenigde Staten, waardoor de noodzaak tot verder onderzoek naar bacteriofagen verdween. Inmiddels kijkt de wereld, geplaagd door multiresistente bacteriën en sombere toekomstscenario’s met onbehandelbare infecties, met een bredere blik naar antimicrobiële mogelijkheden. De toegenomen aandacht blijkt uit publicaties over het gebruik van bacteriofagen bij infecties met ESKAPE-bacteriën (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, en Enterobacter-speciës).[1] Na het beschikbaar komen van antibiotica rond 1940 experimenteerden de instituten in Polen, Rusland en Georgië wel verder met bacteriofagen, al bleef de hoeveelheid bruikbare literatuur die daaruit voortkwam summier, zoals beschreven in het Feuilleton Faagtherapie in NTMM, september 2020. Dit artikel beschrijft een aantal klinische casussen en laboratoriumervaring met bacteriofagen.

Casusbeschrijvingen
In het Radboudumc in Nijmegen werden wij in de afgelopen jaren geconfronteerd met diverse patiënten die zelf voor bacteriofaagtherapie hadden gekozen vanwege chronische bacteriële infecties die niet goed reageerden op antibiotica. De ziektebeelden van deze patiënten liepen uiteen.

De eerste patiënt die vroeg of bacteriofagen toegediend mochten worden in het ziekenhuis leed aan Pseudomonas aeruginosa-bacteriëmie vanuit een met P. aeruginosa gekoloniseerde, 18 jaar bestaande Clagett-holte. De familie van deze patiënt had een bacteriofagenoplossing opgehaald bij het 93 jaar oude Eliava Instituut in Tbilisi, Georgië. De bacteriofagenoplossing met natuurlijk voorkomende lytische fagen wordt geleverd onder de naam ‘Intestiphage’ en zou werkzaam zijn tegen zeven verschillende grampositieve en gramnegatieve bacteriën, waaronder Pseudomonas aeruginosa. In ons laboratorium onderzochten we deze oplossing op werkzaamheid tegen drie verschillende stammen, een P. aeruginosa-stam uit bloed en twee stammen uit pus uit de Clagett-holte. De fagen vertoonden geen lytische werking tegen de pseudomonasstammen uit pus, zowel in vitro als in vivo. De holte werd diverse malen gespoeld met Intestiphage. De patiënt overleed uiteindelijk aan een aortale bloeding in de holte. Deze casus illustreert dat bacteriofagen sterk gespecialiseerd zijn en dat een onbekende bacteriofagenoplossing altijd op functionaliteit moet worden getest.

De tweede patiënt leed aan recidiverende P. aeruginosa-bacteriëmie vanwege een geïnfecteerd endovasculair focus (TIPS) in de levervenen die niet kon worden verwijderd. Voor deze casus kwamen halverwege 2019 infectioloog Jaap ten Oever, apotheker Roger Brüggemann en arts-microbioloog Saskia Kuipers bijeen om voor de Inspectie een “Onderbouwing voor de afwezigheid van een adequaat medicamenteus alternatief” te schrijven, met als doel antipseudomonasbacteriofagen uit het Militair Hospitaal Koningin Astrid in Leuven (België) te importeren. Dat stuitte echter op twee bezwaren. De Inspectie (IGJ) had nog geen ervaring met dergelijke aanvragen. Ook de apotheker, die niet kon beloven dat het medicament steriel was, liep aan tegen grenzen die in de regels van de magistrale bereiding waren vastgelegd. De patiënt week uit naar België voor therapie met bacteriofagen in combinatie met twee antipseudomonale middelen, waardoor zijn infectieuze probleem verdween.

Een derde patiënt had na zijn niertransplantatie last van recidiverende urineweginfecties met hardnekkige urethritis door een ESBL-bevattende Klebsiella pneumoniae. Er was geen sprake van prostatitis. Vele kuren meropenem, later gecombineerd met amikacine blaasspoelingen, leidden niet tot genezing. De urineweginfectie recidiveerde keer op keer. Hierop stuurde deze patiënt zelf zijn urine naar het Eliava Instituut in Tbilisi in de hoop dat er werkzame bacteriofagen te vinden waren. Het pakket met ampullen met bacteriofagen uit Tbilisi werd door een Belgische kennis in ontvangst genomen, want de Nederlandse wet verbiedt bacteriofagen per post te verzenden.

Het lukte ons niet te achterhalen hoeveel verschillende anti-Klebsiella pneumoniae-bacteriofagen in de ampullen aanwezig waren. Wel konden we in ons laboratorium aantonen dat er lytische activiteit was tegen de K. pneumoniae-stam uit de urinewegen van onze niertransplantatiepatiënt. Hij diende zelf zijn bacteriofagen oraal en intravesicaal toe, want hij had al ervaring met blaasspoelingen met amikacine. Zijn urethritisklachten verminderden zodra de bacteriofagen intravesicaal waren ingebracht. Door ingestie van fagen verdween ook het darmdragerschap van ESBL-bevattende Klebsiella pneumoniae tot onder detecteerbare niveau. Hij genas van zijn chronische infectie met de combinatie van langdurig meropenem en bacteriofagen. De patiënt is in de daarop volgende 18 maanden klachtenvrij gebleven. Zijn succesverhaal werd getoond in de tv-uitzending van “Dokters van Morgen” van februari 2020 en is met zijn toestemming beschreven in Antimicrobial Agents and Chemotherapy.[2] 

Bacteriofagengebruik in de literatuur
Bacteriofagentherapie is sporadisch beschreven bij Pseudomonas aeruginosa-sepsis en bij P. aeruginosa-pneumonie bij taaislijmziekte en na longtransplantatie, zowel met als zonder antibiotische behandeling en zowel intraveneus als via inhalatie.[3]

Op het gebied van urogenitale infecties verscheen er dit jaar een artikel over een klinische trial naar het gebruik van bacteriofagen bij urineweginfecties na TURP. Hierbij werd de gestandaardiseerde bacteriofagenoplossing Pyophage intravesicaal vergeleken met een orale antibioticumkuur.[4] De suspensie was werkzaam tegen zes verschillende bacteriën en werd zo nodig verrijkt met nieuwe fagen. Pyophage bevatte echter geen fagen gericht tegen Klebsiella-speciës. Pyophage werd in vitro getest tegen de verwekkers van de post-TURP-urineweginfecties bij de patiënten en kon veilig worden gebruikt maar leverde geen voordeel op ten opzichte van de antibioticumkuur. Het moet nog worden bewezen dat gepersonaliseerde therapie met grotere concentraties specifieke bacteriofagen gericht betere resultaten geeft. Op theoretische gronden zou een persoonlijke bacteriofaagtherapie - met een geconcentreerde cocktail van actieve fagen werkzaam tegen de specifieke verwekker van de chronische infectie - tot betere resultaten kunnen leiden dan een reeds bereid combinatieproduct. Voor de persoonlijke bacteriofaagtherapie is circa één tot twee weken tijd nodig naast de bacteriële verwekker van de chronische infectie en een reeds bestaande ‘phage library’.

Laboratoriumonderzoek naar
bacteriofagen
Welke diagnostiek voeren wij uit in ons micro-biologische laboratorium als we een bacteriofagenoplossing uit Georgië aangeboden krijgen? We keken de kunst af van Stan Brouns bij de TU Delft, waar een van onze analisten stage kon lopen.

Om de aanwezigheid van werkzame bacteriofagen tegen de pseudomonas- en klebsiellastammen te bestuderen voeren wij een zogeheten ‘spot’-test uit. Deze test maakt gebruik van een dubbele laag agar, te weten een vaste voedingsbodem en een wat zachtere topagar. De vaste voedingsbodem is niet alleen een voedingsstoffenleverancier voor de bacteriën maar ook een aanhechtingsmedium voor de topagar. De topagar bestaat uit 4 milliliter 0,6 procent ‘cation-adjusted’ Mueller Hintonagar, waaraan 100 microliter van de te onderzoeken bacteriestam in stationaire groeifase is toegevoegd. Boven op deze zachtere agar wordt een druppel bacteriofaagsuspensie gepipetteerd. Daarna wordt de plaat gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius geïncubeerd. Dit geldt voor bacteriën die in 18 uur optimaal bij die temperatuur groeien, zoals de meeste stafylokokken, enterobacteriën en niet-fermentoren. Als er plaques zijn gevormd in de topagar daar waar de druppel met bacteriofagen is aangebracht, dan is er lyse (afbraak) van de bacterie oftewel lytische activiteit van de onderzochte fagen, en zijn de bacteriofagen in de plaques inzetbaar als therapie. Overigens lijkt de grootte van de plaques samen te hangen met de capside-kop van de bacteriofaag. In 2016 beschreven Jurczak-Kurek et al. dat bacteriofagen met een kleinere capsidekop juist grotere plaques vormen dan die met een grote capsidekop, juist omdat de fagen met een kleinere kop makkelijker door de agar kunnen bewegen.[5]

De afzonderlijke bacteriofagen uit de Georgische Intestiphage-ampullen zijn verrijkt door ze te oogsten uit plaques met dezelfde morfologie met behulp van een steriele houten prikker. Deze prikker wordt vervolgens gestoken in een verse voedingsbodem met topagar geënt met een bacteriestam, om daarna de bacteriofagen over de hele plaat te verdelen met een geautoclaveerd papieren stripje. De geoogste bacteriofagen worden opgelost en gestabiliseerd door een overnacht incubatiestap in een buffer bij 4˚ Celsius. Daarna wordt de inhoud vermengd met chloroform, gecentrifugeerd, gefilterd door een 0,22 micrometer filter om alle bacterieresten te verwijderen, en ingevroren tot verder gebruik.

Beschouwing
Bacteriofagen kunnen een aanvulling zijn in het therapeutisch arsenaal tegen bacteriële infecties, met als voordeel dat het microbioom van de gastheer niet wordt aangetast; maar kunnen bacteriofagen het antimicrobiële resistentieprobleem oplossen? Ook bij gebruik van bacteriofagen treedt resistentie op. Bacteriën kunnen zich op verschillende manieren ongevoeligheid ontwikkelen tegen bacteriofagen door hun oppervlak aan te passen, door hun extracellulaire matrix te gaan verdikken of door een eiwit aan te maken dat genetisch materiaal van de faag weert als dat door de celwand wordt geïnjecteerd. Om resistentievorming tegen te gaan dient men therapeutisch een cocktail aan bacteriofagen te gebruiken. Hopelijk zijn de praktische en juridische uitdagingen rondom bereiding en toediening van bacteriofagen op korte termijn overwonnen. Het spreekt voor zich dat een toe te dienen bacteriofagenoplossing vrij moet zijn van lipopolysachariden en andere contaminanten. Het geven van bacteriofagen waar mogelijk in combinatie met antibiotica kan veelbelovend zijn in de behandeling van chronische infecties, en onderzoek naar de werking van geïndividualiseerde fagentherapie verdient dan ook alle aandacht en financiële steun. Het onderwerp ‘diagnostiek en behandeling met bacteriofagen’ mogen wij als microbiologen absoluut niet laten liggen!

Met dank aan Mike Mientjes, Stan Brouns en Jakko van Ingen voor het mogelijk maken van dit werk.

Samenvatting
De influenza-epidemie van het seizoen 2019/2020 was mild en duurde kort, van week 5 tot en met week 7 en in week 10 en 11 van 2020. De toename van het aantal personen met een influenza-achtig ziektebeeld per 10.000 inwoners, zoals gerapporteerd door huisartsen, vanaf week 10 overlapte met de eerste weken van de COVID-19-pandemie in Nederland en ging gepaard met een snelle afname van influenzavirusdetecties. De pieken in de incidentie van influenza-achtige ziektebeelden per 10.000 inwoners lagen in deze twee periodes op respectievelijk 7,2 in week 5 en 11,5 in week 11. Net als in het seizoen 2018/2019 werden influenza A(H1N1)pdm09- en A(H3N2)-virussen ongeveer even vaak gedetecteerd en circuleerde er weinig influenzavirus type B, hoofdzakelijk van de B/Victoria-lijn. Ongeveer 67 procent van de circulerende A(H3N2)-virussen behoorde tot clade 3C.3a, waartoe ook de vaccinstam voor 2019/2020 behoorde. De overige A(H3N2)-virussen behoorden tot varianten binnen clade 3C.2a1b die antigeen verschillend waren van de vaccinstam. De A(H1N1)pdm09-virussen behoorden genetisch vrijwel allemaal tot clade 6b.1A5, met goede antigene gelijkenis met de vaccinstam in tests met frettensera. Een kleine groep A(H1N1)pdm09-virussen vertoonde antigene verschillen. De B/Victoria-virussen behoorden allemaal tot clade 1A met een deletie van drie aminozuren in hemagglutinine. De voorlopige analyse van de vaccineffectiviteit tegen laboratorium-bevestigde influenzavirusinfectie in Europa was ongeveer 48 procent. Onder de virussen die onderzocht zijn op gevoeligheid voor neuraminidaseremmers en Baloxavir marboxil werd geen resistentie waargenomen.

Voor het influenzaseizoen 2020/2021 heeft de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor het noordelijk halfrond de volgende vaccinsamenstelling aanbevolen:

• Voor A(H1N1)pdm09 een A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019-achtig virus;
• Voor A(H3N2) een A/Hong Kong/2671/2019-achtig virus;
• Voor de B/Victoria-lijn een B/Washington/2/2019-achtig virus;
• Voor de B/Yamagata-lijn een B/Phuket/3073/2013-achtig virus.

Abstract
The influenza epidemic of 2019/2020 started in week 5 of 2020, was relatively mild and lasted only 5 weeks. The epidemic reached peak incidence in weeks 5 and 11 with 7,2 and 11,5 persons presenting with influenza-like illness (ILI) per 10.000 inhabitants respectively and incidence dropping below the epidemic threshold in weeks 8 and 9. The second part of the epidemic overlapped with the start of the COVID-19 pandemic in The Netherlands, when influenza virus detections decreased rapidly. Influenza A(H1N1)pdm09 and A(H3N2)-viruses were detected at approximately equivalent frequencies with only sporadic detection of influenza B viruses. Approximately 67 percent of the circulating A(H3N2)-viruses belonged to clade 3C.3a, like the vaccine. The remaining A(H3N2)-viruses belonged to clade 3C.2a1b with antigenic diversity within this group. Most A(H1N1)pdm09-viruses belonged to clade 6b.1A5 and reacted well with ferret antisera raised against the vaccine strain but a subgroup of antigenically distinct viruses emerged. Almost all influenza B viruses were of the B/Victoria lineage, clade 1A, with a deletion of 3 amino acids in hemagglutinin. Interim results estimated a 48 percent vaccine effectiveness in Europe. There was no evidence for resistance against neuramaminidase inhibitors and Baloxavir marboxil in the investigated influenza viruses.

Griep
Iedere winter kunnen influenzavirussen van het type A, B of C bij mensen griep veroorzaken.[1] Influenzavirussen van het type A en influenzavirussen van het type B zijn afwisselend verantwoordelijk voor de grootste ziektelast tijdens deze influenza-epidemieën, waarbij de impact van type C-virussen relatief beperkt is. De influenzavirussen van type A behoren tot de subtypen A(H1N1)pdm09 en A(H3N2), terwijl het voor de influenzavirussen van type B antigene varianten betreft die als Yamagata-lijn en Victoria-lijn worden aangeduid.[2]
Mensen van 60 jaar en ouder en patiënten met een medische indicatie worden in het kader van het Nationaal Programma Grieppreventie jaarlijks in oktober en november door de huisarts uitgenodigd om een griepprik te halen. In Nederland wordt hiervoor sinds 2019/2020 een quadrivalent griepvaccin aangeboden. Dit vaccin bevat steeds de meest recente door de WHO aanbevolen componenten voor A(H1N1)pdm09, A(H3N2), B/Yamagata en B/Victoria.[3,4] De vaccinsamenstelling wordt twee keer paar jaar opnieuw bekeken, respectievelijk voor het noordelijk en zuidelijk halfrond, op grond van epidemiologische en virologische gegevens die verzameld worden binnen een door de WHO gecoördineerd internationaal surveillancenetwerk. Nadat de nieuwe aanbeveling van de vaccinsamenstelling is vrijgegeven hebben vaccinproducenten ongeveer een half jaar de tijd om een nieuw vaccin voor het eerstvolgende seizoen te produceren en distribueren.[5]

Influenzasurveillance
Een goede overeenkomst tussen de antigene eigenschappen van de circulerende influenzavirussen van het seizoen en de componenten in het vaccin zijn belangrijk voor een goed werkend griepvaccin. Om deze ‘matching’ optimaal te houden worden antigene veranderingen in de circulerende influenzavirussen continu in kaart gebracht binnen het door de WHO gecoördineerde Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS).[6]
Het Nationaal Influenza Centrum rapporteert namens Nederland wekelijks de gegevens over de Nederlandse epidemie aan de WHO via het European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Om de Nederlandse data te integreren met die van elders in Europa en in de wereld wordt een selectie van de in Nederland verzamelde en gekarakteriseerde influenzavirussen opgestuurd naar het WHO Collaborating Centre in London.
Het Nivel (Nederlands instituut voor onderzoek van de gezondheidszorg) registreert wekelijks het aantal patiënten dat zich met een influenza-achtig ziektebeeld (IAZ) meldt bij de huisarts en vraagt de huisartsen om een deel van deze patiënten te bemonsteren. De influenzavirussen verkregen uit luchtwegmonsters van een groot aantal huisarts- en ziekenhuispatiënten met IAZ en van patiënten met andere acute respiratoire infecties (ARI) worden door RIVM en Erasmus MC binnen het Nationaal Influenza Centrum gekarakteriseerd. Hiertoe worden de genetische en antigene eigenschappen van de virussen bepaald en de gevoeligheid voor antivirale medicijnen vastgesteld. In het verleden werd voor een representatieve subset van de fenotypisch gekarakteriseerde virussen de genetische eigenschappen bepaald. Sinds het seizoen 2018/2019 wordt deze volgorde steeds vaker omgedraaid waarbij aan de hand van de genetische karakterisering met moderne sequentietechnieken een fenotype kan worden voorspeld, dat vervolgens experimenteel wordt bevestigd voor een representatieve set monsters waaruit virus is geïsoleerd.

Resultaten en discussie

De influenza-epidemie van het seizoen 2019/2020
De influenza-epidemie van 2019/2020 duurde in totaal vijf weken, van week 5 tot en met week 7 en in weken 10 en 11 van 2020 (zie figuur 1). In Nederland spraken we in het seizoen 2019/2020 van een epidemie wanneer in twee opeenvolgende weken meer dan 5,8 op de 10.000 mensen zich bij hun huisarts meldden met IAZ en tegelijkertijd in de neus- en keelmonsters van een substantieel deel van deze patiënten influenzavirus werd aangetoond.[7] Het eerste deel van de epidemie van week 5 tot en met 7 voldeed volledig aan deze norm. Van week 10 tot 14 was de IAZ-incidentie ook boven de norm van 5,8 op de 10.000 mensen, maar werd er vanaf week 12 nauwelijks nog influenzavirus aangetoond, waardoor er toen van een influenza-epidemie geen sprake meer kon zijn. De verhoogde IAZ-incidentie in deze tweede periode viel samen met de aanvang van de COVID-19-pandemie in Nederland, waarbij in weken 10 en 11 de eerste aanbevelingen werden gedaan om de verspreiding te beperken. De influenza-epidemie van 2019/2020 duurde daarmee veel korter dan de epidemie van het jaar daarvoor (14 weken) en korter dan het gemiddelde van 10 weken van de laatste 25 jaar.[8,9]
In het winterseizoen van 2019/2020 hadden relatief weinig mensen een IAZ (zie figuur 1). De pieken in de incidentie van influenza-achtige ziektebeelden per 10.000 inwoners lagen in de twee periodes van de influenza-epidemie op respectievelijk 7,2 in week 5 en 11,5 in week 11 (zie figuur 1). Al met al was er sprake van een relatief milde en kortdurende influenza-epidemie in Nederland.

Overzicht van de onderzochte influenzavirussen
De influenza-epidemie van 2019/2020 werd gedomineerd door influenzavirussen van type A, waarbij A(H3N2) en A(H1N1)pdm09-virussen net als vorig seizoen ongeveer even vaak werden gedetecteerd in de peilstations en de ziekenhuizen (zie tabel 1). Net als vorig jaar was de prevalentie van influenzavirus type B opvallend laag. In de 203 volledig gekarakteriseerde influenzavirus-positieve monsters afgenomen door peilstationhuisartsen bij IAZ-patiënten werd 101 keer (50 procent) een A(H3N2)-virus gevonden, 86 keer (42 procent) een A(H1N1)pdm09-virus, 15 keer (7,5 procent) een influenzavirus type B van de Victoria-lijn en 1 keer (0,5 procent) een influenzavirus type B van de Yamagata-lijn. In de 48 van ARI-patiënten afgenomen influenzavirus-positieve monsters werd 32 keer (67 procent) een A(H3N2)-virus gevonden, 11 keer (23 procent) een A(H1N1)pdm09-virus en 5 keer (10 procent) een influenzavirus type B van de Victoria-lijn (zie tabel 1 en figuur 2). Van de 765 door diagnostische ziekenhuislaboratoria aangemelde influenzavirussen waren er 747 (98 procent) van het A-type en 18 (2 procent) van het B-type. Van de verder gekarakteriseerde A virussen waren er 201 (51 procent) van het A(H1N1)pdm09 subtype en 185 (47 procent) van het A(H3N2) subtype. Van de verder gekarakteriseerde B virussen behoorden er 8 tot de Victoria-lijn (zie tabel 1 en figuur 3).

Karakterisering van influenza A(H1N1)pdm09-virussen
Alle A(H1N1)pdm09-virussen van dit seizoen die werden onderzocht, behoorden genetisch tot clade 6B.1A, met additionele genetische verschillen tussen de virussen onderling (zie figuur 4a). De grootste groep virussen behoorde tot clade 6B.1A5A met aminozuursubstitutie 187V/A net als A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019, de vaccinstam voor het seizoen 2020/2021.[10] Een tweede grote groep virussen behoorde tot dezelfde clade 6B.1A5A maar met de aminozuursubstitutie 156K net zoals A/Victoria/2570/2019, de vaccinstam voor 2021 voor het zuidelijk halfrond.[11] Verder werden er diverse clade 6B.1A5A-virussen zonder bijzondere aminozuursubstituties gevonden en sporadisch ook virussen van clade 6B.1A5B en 6B.1A7.
Sinds de pandemie van 2009 hebben de A(H1N1)pdm09-virussen nog weinig antigene variatie laten zien in de hemagglutinatieremmingstest (HAR) met frettensera (minder dan een factor 4 verschil in titers gemeten met sera tegen verschillende A(H1N1)pdm09-stammen). Nagenoeg alle Nederlandse A(H1N1)pdm09-virussen van het afgelopen seizoen vertoonden goede antigene overeenkomst met frettensera opgewekt tegen de 2019/2020-vaccincomponent A/Brisbane/2/2018 in de HAR-test (zie tabel 2). Ook reageerden deze Nederlandse A(H1N1)pdm09-virussen goed met frettensera opgewekt tegen de Nederlandse prototypevirussen van de afgelopen seizoenen. Echter, voor het eerst werd nu in de HAR een antigeenafwijkend patroon gezien voor (H1N1)pdm09, namelijk met een virus van clade 6B.1A5A met aminozuursubstitutie 156K (A/Nederland/121/2020). A/Victoria/2570/2019, de vaccincomponent voor het zuidelijk halfrond, heeft dezelfde 156K-substitutie. Voor het noordelijk halfrond heeft de WHO een A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019-achtig virus aanbevolen dat tot dezelfde clade behoort als de grootste groep virussen uit Nederland, clade 6B.1A5A met substitutie 187A/V. Deze update ten opzichte van A/Brisbane/2/2018 is gebaseerd op HAR-data met een set humane sera uitgevoerd door de WHO Collaborating Centres, waarmee kleine antigene verschillen werden waargenomen ten opzichte van A/Brisbane/2/18 die met frettensera niet zijn waar te nemen.[10,11]

Karakterisering van influenza A(H3N2)-virussen
Genetische analyse van het hemagglutinine gen van de in Nederland circulerende A(H3N2)-virussen toonde net als voorgaande jaren forse genetische diversiteit aan (zie figuur 4b). Ongeveer 67 procent van de in Nederland gekarakteriseerde A(H3N2)-virussen behoorden tot clade 3C.3a, zodat de vaccinkeuze voor A/Kansas/14/2017 (clade 3C.3a) voor Nederland goed heeft uitgepakt. De overige gekarakteriseerde virussen behoorden tot clade 3C.2a1b, met diverse additionele aminozuursubstituties in hemagglutinine. In Nederland kwamen clade 3C.2a1b-virussen met T131K ongeveer zes keer zo vaak voor als virussen met T135K. Door de wereldwijde toename in circulatie van clade 3C.2a1b-virussen met T135K is besloten om een A/Hong Kong/2671/2019-achtig virus met deze substitutie aan te bevelen voor het 2020/2021-vaccin voor het noordelijk halfrond.[10]

Het maken van een gedegen keuze voor de A(H3N2)-vaccincomponent is momenteel niet alleen lastig door de genetische diversiteit maar ook omdat een groot deel van de virussen niet of nauwelijks in staat is rode bloedcellen te agglutineren of hoofdzakelijk via neuraminidase.[12,13] Hierdoor is de HAR-test voor de karakterisering van hemagglutinine niet betrouwbaar en is een alternatieve virusneutralisatie (VN)-test ontwikkeld, die helaas minder reproduceerbaar en meer bewerkelijk is.[13-15] Daarnaast zijn de gekozen vaccinstammen vaak genetisch instabiel gebleken in eieren, waardoor deze de laatste jaren vaak antigene verschillen lieten zien ten opzichte van de epidemische stammen die niet in eieren zijn gekweekt. De antigene eigenschappen van A(H3N2)-virussen van 2019/2020 waren heterogeen, net als vorig seizoen (zie tabel 3). Frettensera opgewekt tegen de A/Kansas/14/2017-vaccinstam X-327 en A/Nederland/384/2019 van vorig seizoen uit clade 3C.3a lieten lage titers zien tegen A(H3N2)-virussen van clade 3C.3a uit het seizoen 2019/2020. Hoewel de keuze voor een clade 3C.3a-vaccinstam op zich de juiste was voor Nederland, was de antigene matching met de epidemische 3C.3a-stammen waarschijnlijk suboptimaal. De antisera tegen de clade 3C.3a-virussen reageerden, zoals verwacht mocht worden, niet met virussen van clade 3C.2a1b. Binnen de clade 3C.2a1b-virussen was enige antigene heterogeniteit zichtbaar, die deels samenhangt met substituties T131K en T135K in HA. De frettensera opgewekt tegen deze clade 3C.2a1b-virussen gaven helaas te lage titers om overtuigend verschillen aan te tonen. Serum opgewekt tegen de referentiestam IVR-197 gaf geen meetbare titers tegen clade 3C.2a1b-stammen met T135K zoals ook binnen het WHO-netwerk werd gemeld en waardoor besloten is het vaccin aan te passen met een stam met de T135K-substitutie, een A/Hong Kong/2671/2019-achtig virus.[10]

Karakterisering van influenza B-virussen
In seizoen 2019/2020 werd in Nederland slechts één influenzavirus type B van de Yamagata-lijn gedetecteerd maar deze kon door de lage hoeveelheid virus in het monster niet verder worden gekarakteriseerd. Wereldwijd werden geen substantiële antigene veranderingen waargenomen in B/Yamagata-virussen, waardoor de vaccinkeuze voor een B/Phuket/3073/2013-achtig virus niet werd gewijzigd ten opzichte van vorig seizoen.[10]
Alle in het seizoen 2019/2020 gekarakteriseerde influenzavirussen type B van de Victoria-lijn behoorden tot clade 1A, met een deletie van drie aminozuren in hemagglutinine. De vaccincomponent en de referentiestam voor het seizoen 2019/2020 behoorden tot dezelfde clade, maar hebben een deletie van twee aminozuren in hemagglutinine. De nieuwe vaccinkeuze voor het noordelijk halfrond voor 2020/2021 is een B/Washington/2/2019-achtig virus, dat een deletie heeft van drie aminozuren en genetisch nauw verwant is aan de Nederlandse virussen van 2019/2020 (zie figuur 4c).[10]
Zoals verwacht op basis van de aminozuurdeleties in hemagglutinine reageerden de frettensera opgewekt tegen de referentiestam B/Colorado/6/2017, en de vaccinstam B/Maryland/15/2016 suboptimaal met de Nederlandse virussen uit 2019/2020 met een deletie van drie aminozuren. Omdat dit wereldwijd werd waargenomen is besloten de B/Victoria-vaccinstam aan te passen voor het seizoen 2020/2021 voor het noordelijk halfrond naar een B/Washington/2/2019- achtig virus.[10] De titers van een frettenserum opgewekt tegen B/Washington/2/2019 waren hoger dan de titers van een serum opgewekt tegen de oude vaccinstam. Er is echter ook enige diversiteit zichtbaar tussen de B/Victoria-virussen met een deletie van drie aminozuren onderling.

Vaccineffectiviteit
Uit de interim-resultaten aan het einde van het griepseizoen van de Europese I-MOVE-studie waaraan Nederland deelneemt, werd een influenzavaccineffectiviteit van 48 procent gemeten tegen alle influenzavirussen. De effectiviteit was 45 procent tegen A(H1N1)pdm09-virussen, 49 procent tegen A(H3N2)-virussen en 57 procent tegen influenzavirussen van type B. De vaccineffectiviteit was het laagst bij personen ouder dan 65 jaar.

Vaccinsamenstelling voor het seizoen 2020/2021
Op 28 februari 2020 adviseerde de WHO voor het noordelijk halfrond over de samenstelling van het influenzavaccin voor 2020/2021. De enige component die niet werd aangepast is die voor de B/Yamagata-lijn. De geadviseerde samenstelling is:[9]

• A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1)pdm09-achtig virus;
• A/Hong Kong/2671/2019 (H3N2)-achtig virus;
• B/Washington/02/2019-achtig virus, van de Victoria-lijn;
• B/Phuket/3073/2013-achtig virus, van de Yamagata-lijn.

Gevoeligheid voor antivirale middelen
Tijdens het seizoen 2019/2020 werd voor 454 influenzavirussen de sequentie van het neuraminidasegen onderzocht op aminozuursubstituties die resistentie tegen neuraminidaseremmers kunnen veroorzaken, maar werden deze substituties niet gevonden. Ook werd er geen fenotypische resistentie gemeten in een kleinere groep virussen. Omdat verwacht wordt dat de endonuclease-remmer Baloxavir marboxil (Xofluza^®) binnenkort op de markt komt voor de behandeling van influenza, werd ook de sequentie van het PA-polymerasegen van 166 virussen geïnspecteerd, waarbij geen mutaties aan het licht kwamen waarvan bekend is dat ze resistentie veroorzaken. In het seizoen 2019/2020 werd niet gezocht naar resistentie tegen M2-ionkanaalblokkers omdat dergelijke medicijnen nauwelijks meer worden voorgeschreven en de A(H3N2)- en A(H1N1)pdm09-influenzavirussen die de laatste jaren wereldwijd werden getest nagenoeg allemaal de S31N aminozuursubstitutie droegen die verantwoordelijk is voor resistentie.

Conclusie
De influenza-epidemie van 2019/2020 was een korte en milde epidemie die hoofzakelijk werd veroorzaakt door A(H3N2)- en A(H1N1)pdm09-virussen. Net als vorig jaar werden er nauwelijks influenza B-virussen gedetecteerd. De epidemie verliep in twee fasen, waarbij de tweede piek in IAZ-incidentie van week 10 tot 14 overlapte met de start van de COVID-19-pandemie in Nederland. Na week 11, toen de eerste aanbevelingen werden gedaan om de verspreiding van SARS-CoV-2 te beperken, werd nauwelijks nog influenzavirus gedetecteerd terwijl de frequentie van SARS-CoV-2-detecties op liep. De tweede IAZ-piek had waarschijnlijk dus meer te maken met COVID-19 dan met influenza.
De interim-resultaten van de I-MOVE-studie gaven een vaccineffectiviteit van 48 procent voor 2019/2020. Voor zowel A(H3N2) als A(H1N1)pdm09 circuleerden er in 2019/2020 meerdere genetische varianten die grote antigene verschillen vertoonden, waardoor voor de influenzavirussen van type A de vaccinkeuze opnieuw lastig is voor het seizoen 2020/2021. Deze keuze werd nog verder bemoeilijkt doordat de vaccins die in eieren geproduceerd worden aminozuurveranderingen in hemagglutinine ondergaan en daardoor nog meer afwijken van de epidemische virussen.

Dankbetuigingen
Wij zijn de peilstationhuisartsen van Nivel Zorgregistraties eerste lijn (registratie van gevallen van IAZ en verzending van klinische monsters naar het NIC-RIVM) zeer erkentelijk voor hun bijdragen, die essentieel zijn voor de influenzasurveillance in Nederland. Zonder de bereidwilligheid van de diagnostische laboratoria om influenzavirusmonsters naar NIC-Erasmus MC te sturen, was deze surveillance evenmin mogelijk geweest.

The authors gratefully acknowledge the generous gift of influenza reference viruses and antisera from Dr. J. McCauley from the World Influenza Centre in London.

De auteurs danken verder R. van Beek, M. Pronk, P. Lexmond, M. Silva (NIC-Erasmus MC), W. van der Hoek, M. Bagheri, G. Goderski, S. van den Brink, L. Wijsman, P. Overduin, J. Sluimer, drs. D. Reukers, drs. F. Dijkstra en dr. A. Teirlinck (NIC-RIVM) en E. Wentink, M. Hooiveld, Y. Weesie, L. Verberne en J. Gravestein (Nivel) voor de uitstekende technische ondersteuning.

Samenvatting
Onder tijdsdruk worden in het Jeroen Bosch Ziekenhuis en het Ziekenhuis Bernhoven de Corona Result Viewer en het Corona Dashboard ontwikkeld. Met behulp van laboratorium- en ziekenhuisdata wordt de epidemiologische informatie rondom patiënten met een positieve uitslag voor SARS-CoV-2 toegankelijk voor artsen-microbioloog, hygiëne- en infectiepreventiemedewerkers, aanvragers en supportteams. De systemen bieden geaggregeerde laboratoriumuitslagen en een grafische weergave van de dynamiek.

Abstract
The development of two databases is described in two Dutch hospitals situated in the epicentre of the SARS-CoV-2 pandemic. Test results are combined with epidemiological information and presented graphically in order to render insight in the hospital orientated dynamics to clinical microbiologists, support teams and applicants of the test.

Inleiding
Eind februari wordt na verontrustende berichten uit China en Noord-Italië in Nederland de eerste COVID-19-patiënt gediagnosticeerd. Om onopgemerkte SARS-CoV-2-transmissie vroegtijdig op te sporen, wordt in week 10 in het Jeroen Bosch Ziekenhuis (JBZ, Den Bosch) en in Ziekenhuis Bernhoven (BNH, Uden) naast de influenzadiagnostiek, ook COVID-19-diagnostiek ingezet bij patiënten met verdenking griep (figuur 1). Begin maart is 35 procent van de testaanvragen positief voor influenza en worden de eerste positieve monsters met het SARS-CoV-2-virus vastgesteld. Een week later blijkt dat de omgeving van Bernhoven een COVID-19-hotspot is. In de eerste week van maart testen in BNH (130 bedden, adherentie 280.000 personen) 18 van de 108 geteste patiënten positief voor SARS-CoV-2, in het naburige JBZ (600 bedden, adherentie 450.000 personen) 3 van de 184 patiënten. Om de toename van de vraag naar overzichtelijke en geaggregeerde resultaten digitaal te ondersteunen wordt een applicatie ontwikkeld. Hierna beschrijven we enkele toepassingen van deze applicatie tijdens de recente COVID-19-uitbraak in de regio’s rondom Den Bosch en Uden.

Corona Result Viewer
Door de reguliere standaardrapportage komen de resultaten van een COVID-PCR in de grote vergaarbak met de andere resultaten van de betreffende patiënt, terwijl er juist een behoefte is om COVID-19-data gescheiden te analyseren. De data moeten niet op patiënt- maar op testniveau worden geaggregeerd en dienen geactualiseerd beschikbaar te zijn voor de eindgebruikers. Dat zijn de verschillende ziekenhuisorganisaties, de coronasupportteams, de ziekenhuishygiëneteams, de bedrijfsartsen en de GGD. Om dit te realiseren wordt de Corona Viewer ontwikkeld. Aanvankelijk, eind februari, is het de bedoeling de COVID-19-data op te nemen in de Influenzamonitor, die er binnen het JBZ is. De COVID-19-data kunnen op eenzelfde wijze als de RSV-data aan de Influenzamonitor worden toegevoegd, te weten met een duiding in de kantlijn. Al na enkele dagen blijkt dat een aparte monitor gemaakt moet worden. Deze Corona Result Viewer (CRV) geeft alle geaggregeerde COVID-19-PCR- gerelateerde data per dag per patiënt weer. Vanuit het laboratoriuminformatiesysteem worden ieder half uur, alle COVID-19-testen (wel en niet afgeronde testen) geëxporteerd naar het beveiligde netwerk van het JBZ. Software (R-script) transformeert de gegevens naar zinvolle informatie op patiëntniveau. Per patiënt per dag wordt één regel weergeven in de CRV, waarbij drie uitslagen mogelijk zijn: ‘negatief’ indien alle testen met dezelfde afnamedatum negatief en afgerond zijn, ‘positief’ indien één test positief is, en ‘in behandeling’ als er nog niet afgeronde testen zijn én er geen afgeronde positieve test is. De relevante data worden vervolgens zichtbaar gemaakt via een HTML5-website opgeslagen in het netwerk van het JBZ, en beschikbaar gesteld voor specifieke gebruikers in en buiten het JBZ, dus ook voor BNH en de GGD. Per gebruiker/ gebruikersgroep worden uitsluitend gerelateerde uitslagen aangeboden.

Privacy
De Algemene verordening gegevensbescherming (AVG) stelt dat toegang tot uitslagen van testen alleen mag worden verleend indien men een behandelrelatie met de patiënt heeft. Het Outbreak Management Team (OMT) van het ziekenhuis heeft per decreet verordend dat dit in deze situatie geen grond heeft. In samenspraak met juridische zaken wordt een disclaimer in de CRV opgenomen die de verantwoordelijkheid voor juist gebruik bij de eindgebruiker legt. Dit is aan alle interne (JBZ) en externe gebruikers (BNH/GGD) meegedeeld. Voor externe partijen zijn ook op bestuurlijk niveau (RvB) de verantwoordelijkheden voor het gebruik afgestemd en overgedragen.

Dataveiligheid
De technische veiligheid is afgestemd met de dataveiligheidsexpert van de afdeling ICT. Omdat de CRV binnen het netwerk van het JBZ wordt opgeslagen, moet voor externe partijen toegang worden geregeld tot het JBZ-netwerk. Dit wordt gerealiseerd door op naam gestelde gebruikersaccounts aan te maken waarmee uitsluitend toegang wordt geboden aan de CRV. In deze constructie worden twee beveiligingen aangebracht, authenticatie in twee stappen en het loggen van de gebruikersnaam, zoals de standaard is voor de JBZ-accounts. Wegens tijdsgebrek wordt ‘wie-ziet-wat-wanneer’ niet geborgd. Daarbij zal het antwoord op het ‘wat’-gedeelte in de ‘wie-ziet-wat-wanneer’-vraag altijd zijn ‘alles wat er in de CRV staat’ en de ‘wie en wanneer’ zal te herleiden zijn uit het log-register van de betreffende account.

De Corona Result Viewer in de praktijk
Op 9 maart wordt de CRV in gebruik genomen, aanvankelijk door de bedrijfsartsen, korte tijd later door de Dienst hygiëne en infectiepreventie (later overgenomen door het coronasupportteam) en eind maart de GGD.
De elkaar snel opvolgende vragen om een CRV leidt vervolgens tot ‘klantspecifieke’ CRV’s. Hierdoor kunnen heel precies de juiste patiënten, cliënten en medewerkers worden geraadpleegd. Een nadeel is dat onderhoud van de diverse CRV’s en doorontwikkeling van de brondata een tijdrovende klus wordt. De optimale werkwijze op het laboratorium is begin maart nog niet gevonden, waardoor datastructuren subtiel veranderen, wat consequenties heeft voor de data. De eerste CRV’s worden gevoed met klantspecifieke data. Dit blijkt al snel niet houdbaar, waarna ervoor wordt gekozen om de CRV’s te gaan voeden vanuit één bronbestand. Nu ontstaan er nieuwe uitdagingen omdat er klantspecifieke vragen zijn. Zo wil bijvoorbeeld de GGD graag de telefoonnummers van de patiënten en heeft het coronasupportteam van Bernhoven behoefte aan het lokale patiëntennummer. Data voor de klantspecifieke vragen komen uit andere tabellen en moeten worden samengevoegd met bronbestand. Ondanks het karakter van improvisatie, een beperkt omschreven opdracht onder grote druk, is er door goede samenwerking tussen applicatiebeheer (laboratorium), ICT (ziekenhuis), juridische zaken (JBZ) en data- en informatiemanager een effectief systeem neergezet dat bij diverse interne en externe partijen de administratieve druk flink heeft verlicht.

Het Corona Dashboard
Parallel aan de ontwikkeling van de CRV wordt een Corona Dashboard ontwikkeld. In tegenstelling tot de dataverzameling voor de CRV’s worden de data niet geaggregeerd op testniveau maar op herkomst van de patiënt. Op deze manier wordt bijvoorbeeld de problematiek per ziekenhuis in kaart gebracht. Het Corona Dashboard wordt beschikbaar gesteld aan de artsen-microbioloog en levert via hen gegevens aan het OMT van beide ziekenhuizen. Voor de RvB van de ziekenhuizen wordt een dagelijks rapport gemaakt op basis van deze dataverzamelaar. In de latere fase van de epidemie kunnen de bedrijfsarts en de GGD aanhaken om gebruik te maken van de geaggregeerde data.

Het gebruik van Corona Result Viewer en Dashboard
De viewer is aanvankelijk ontwikkeld om lokale epidemiologie van influenza inzichtelijk te maken. Een opmerkelijk staartje aan het eind van de influenzapiek wordt zichtbaar in figuur 1. Er is een behoorlijke toename in influenza-aanvragen in week 10, 11 en 12. Dit is het moment dat juist het aantal influenzagevallen afneemt, maar dit moment valt samen met het begin van de COVID-19-epidemie (figuur 2). In week 10 (2 maart) wordt in ons laboratorium gestart met COVID-19-diagnostiek met PCR bij influenzanegatieve aanvragen. Ook worden in week 10 de eerste COVID-19-gevallen gediagnosticeerd in Uden en Den Bosch.

De snelle stijging van aantal COVID-19-diagnoses in Uden is opmerkelijk. In het begin is er een verdubbelingstijd van drie dagen (figuur 3). Het valt op dat als de data van twee ziekenhuizen worden samengevoegd, de pieken minder geprononceerd zijn (figuur 2). Waarschijnlijk word dit mitigerende effect versterkt als de data landelijk worden samengevoegd. Dit leidt tot verlies aan inzicht van de lokale epidemiologie.
De oorzaak voor de snelle stijging in Uden is niet bekend. Meervoudige introductie door besmette vakantiegangers in het carnavalsgedruis lijkt het meest aannemelijk.
De verschillen tussen Bernhoven en JBZ in aantallen van geregistreerde besmettingen zijn wel heel opmerkelijk, met name omdat de afstand (20 km) tussen de twee locaties beperkt is (figuur 5).

De snelle daling, die vooral in Bernhoven zeer kort op de maatregelen volgde, kan niet volledig worden verklaard door het effect van die landelijke maatregelen (figuur 2 en 4). Mogelijk is de snelle daling mede veroorzaakt door het einde van het carnaval en doordat de focus van de media gericht was op Noord-Brabant en specifiek op de regio Bernhoven. Misschien heeft ook een rol gespeeld dat eerst regionale maatregelen werden afgekondigd door de burgermeesters van Noord-Brabant. Dit heeft wellicht geleid tot een verhoogd bewustzijn in de regio, waardoor adviezen en maatregelen sneller zijn opgevolgd dan in andere delen van Nederland.

Samenvatting
In februari 2020 verspreidde de COVID-19-epidemie zich in Nederland vooral vanuit Brabant. De ziekenhuisopnames en de sterfte in Brabant (en Limburg) vertoonden een opvallende overeenkomst met de epidemiologische brandhaard van Q-koorts. Wij hebben in het serum van vijftig opgenomen COVID-19-patiënten Q-koorts fase II-IgG bepaald. Wij vonden een opvallend hoge seroprevalentie, namelijk 16 procent, met 18,5 procent bij Brabantse en 13 procent bij Gelderlandse patiënten. De huidige groep is te klein om definitieve conclusies te trekken. In een eventuele toekomstige studie naar de luchtkwaliteit, met name naar fijnstof als risicofactor, is het wellicht zinvol om ook doorgemaakte Q-koorts in de serologische onderzoeken mee te nemen.

Abstract
In February 2020, the COVID-19 epidemic in the Netherlands started mainly in Brabant. The hospital admissions and deaths in Brabant (and Limburg) showed a striking similarity with the epidemiologic hearth of the Q fever outbreak. We have determined Q fever phase II IgG in the serum of fifty COVID-19 patients. We found a remarkably high seroprevalence, almost 16 per cent, with 18.5 per cent in patients in Brabant and 13 per cent in Gelderland. The current group is too small to make definite conclusions. In future studies, on air quality, it is meaningful to include Q fever as risk factor in scientific research too

Inleiding
Sinds februari 2020 verspreidde de COVID-19-epidemie zich in Nederland vooral vanuit Brabant. Hoewel het RIVM van meet af aan een zeer terughoudend testbeleid hanteerde, bleek al snel dat het virus wijdverspreid was onder inwoners van Noord-Brabant. Dit werd enerzijds veroorzaakt door de terugkeer van Nederlanders uit met name Italiaanse en Oostenrijkse vakantiegebieden en anderzijds door zogenaamde ‘superspreading events’ met zeer efficiënte transmissie tijdens carnaval. In het weekend van 6-8 maart werden 1097 medewerkers in Noord-Brabantse ziekenhuizen onderzocht op SARS-CoV-2.[1]. In Tilburg bleek 9,5 procent van de onderzochte medewerkers positief. De meesten hadden geen contact gehad met op dat moment opgenomen COVID-19-patiënten, wat suggereert dat de verspreiding van het virus aanzienlijk groter was dan tot dan toe werd aangenomen. Het aantal opgenomen COVID-19-patiënten en het aantal sterfgevallen in Noord-Brabant nam daarna een grote vlucht. Op 10 juni 2020 waren er 48.087 ziekte- en 6.042 sterfgevallen gerapporteerd in Nederland, waarvan 9439 (19,6 procent) ziekte- en 1523 (25,2 procent) sterfgevallen in Noord-Brabant.[2]

Hoewel in heel Brabant en Limburg uitgebreid carnaval werd gevierd en mensen van wintersportgebieden terugkeerden in diezelfde vakantieperiode, kon dat het extreme aantal patiënten en sterfgevallen in Noordoost Brabant vergeleken met de rest van die provincie niet eenvoudig verklaren. Enerzijds zou het terughoudende testbeleid kunnen bijdragen aan een onderschatting van de werkelijke verspreiding in dit gebied. Anderzijds vertoonden de meldingen en de sterfte in Brabant (en Limburg) een opvallende overeenkomst met de epidemiologische brandhaard van een eerdere zoönotische uitbraak in dezelfde provincies: die van Q-koorts (figuur 1). Deze Q-koortsuitbraak was destijds de grootste ter wereld.[3]
Een groot deel van het verzorgingsgebied van het Canisius Wilhelmina Ziekenhuis (CWZ) bevindt zich in het voormalige Q-koortsgebied. Bovendien werd een deel van de patiënten in het werkgebied van ziekenhuis Bernhoven overgeplaatst naar het CWZ. Wij onderzochten of met name bij onze Brabantse patiënten sprake was van doorgemaakte Q-koorts als additionele risicofactor voor ernstige COVID-19 en sterfte, naast de bekende risicofactoren als mannelijk geslacht, obesitas en diabetes mellitus.

Methoden
In het serum van vijftig patiënten die in het Canisius Wilhelmina Ziekenhuis waren opgenomen met een PCR-bevestigde SARS-CoV-2-infectie werden Q-koorts fase II-IgG-titers bepaald met IFA-techniek (Focus diagnostics, Diasorin USA).
Ziekte-uitkomst werd gedefinieerd als: 1) opgenomen op de COVID-19-afdeling in het ziekenhuis en ontslagen zonder intensivecareopname; 2) opgenomen op de intensivecareafdeling van het CWZ; 3) overleden op de COVID-19-afdeling. Gegevens over comorbiditeiten werden opgevraagd uit het patiëntendossier.
Voor dit onderzoek werd toestemming verleend door de medisch-ethische toetsingscommissie van het CWZ (CWZ-nr. 027-2020; datum toestemming 12 maart 2020). Er werd geen schriftelijke toestemming gevraagd, maar patiënten konden kiezen om niet deel te nemen aan de studie nadat zij mondeling waren geïnformeerd.

Resultaten
In dit onderzoek werden 50 patiënten geïncludeerd, 37 (74 procent) mannen met een gemiddelde leeftijd van 70 jaar (figuur 2). Van hen waren 27 (54 procent) op het moment van opname woonachtig in Brabant en 23 (46 procent) in andere provincies, met name Gelderland.
De seroprevalentie van fase II-IgG (doorgemaakte Q-koorts) was 16 procent, met een serologisch aangetoonde prevalentie van 18,5 procent bij Brabantse en 13 procent bij Gelderlandse patiënten.
Onder de 20 patiënten opgenomen en ontslagen vanaf de COVID-19-afdeling zonder intensivecareopname, waren er vier (20 procent) seropositief. Bij de IC-patiënten waren dit er drie van de 19 (15,7 procent) en van de overleden patiënten één van de 11 (9 procent) (figuur 3). Binnen de verschillende patiëntencategorieën was per provincie geen opvallend verschil waarneembaar.

Discussie
Het is onduidelijk of doorgemaakte Q-koorts een additionele risicofactor vormt voor het doormaken of de ernst van COVID-19. Bij deze preliminaire studie onder patiënten in een ziekenhuis buiten de Q-koortsregio werd wel een hoge seroprevalentie van Q-koorts onder COVID-19-patiënten vastgesteld.
Eerdere studies schatten de seroprevalentie op 12 tot 15 procent.[3-5] Deze zijn echter gebaseerd op serum verzameld onder populaties in hoogrisicogebieden. Er zijn nog weinig data over doorgemaakte Q-koorts in andere regio’s. Gezien het relatief kleine aantal patiënten in de huidige studie en het ontbreken van een geschikte controlegroep zonder COVID-19 is het niet mogelijk te concluderen of Q-koorts een risicofactor vormt, of dat er mogelijk andere risicofactoren een rol spelen.
Binnenkort start het RIVM een studie naar de luchtkwaliteit, met name naar fijnstof als risicofactor. Tevens zullen er waarschijnlijk serologische studies worden verricht om de daadwerkelijke omvang van de COVID-19-epidemie in Noord Brabant beter in kaart te brengen. Wellicht is het, gezien de hoge prevalentie in dit onderzoek, zinvol om in dergelijke brede serologische studies ook doorgemaakte Q-koorts als risicofactor te evalueren.

Samenvatting
Eind februari werd in Nederland de eerste COVID-19-patiënt gediagnosticeerd. Hoe het immuunsysteem de SARS-CoV-2-infectie precies bestrijdt en in hoeverre de respons adequaat is en langdurige bescherming biedt, is op dit moment nog niet duidelijk. In samenwerking met het RIVM is het Diakonessenhuis Utrecht een studie gestart om de immuunrespons bij mensen met verschillende ernst van COVID-19 in kaart te brengen. In het laboratorium van de medische microbiologie van het Diakonessenhuis is een ELISpot ontwikkeld voor het meten van T-celreactiviteit tegen SARS-CoV-2-antigenen. Een recentelijk gepubliceerd artikel over de resultaten van de SARS-CoV-2-ELISpot wordt besproken, evenals de mogelijke rol van (geheugen) T-cellen in de afweer tegen SARS-CoV-2 en gerelateerde virussen.

Abstract
The first COVID-19 patient was diagnosed in the Netherlands at the end of February. Exactly how the immune system fights the SARS-CoV-2 infection and to what extent the response is adequate, is not yet clear. The Diakonessenhuis Utrecht, in collaboration with the RIVM, has started a study to map the immune response in people with different severity of COVID-19 disease. In the medical microbiology laboratory of the Diakonessenhuis, an ELISpot has been developed for measuring T-cell reactivity against SARS-CoV-2 antigens. A recently published article on the results of the SARS-CoV-2 ELISpot is discussed, as well as the recent insights regarding the role of (memory) T-cells in the immune defense against SARS-CoV-2 and related viruses.

In Nederland zijn tot en met 1 september in totaal 71.129 COVID-19-patiënten gemeld en zijn 6230 mensen overleden.[1] Hoge leeftijd is een risicofactor voor een ernstig beloop van COVID-19; van de opgenomen patiënten was de helft 68 jaar of ouder en van de overleden patiënten was de helft 83 jaar of ouder. Zeventig procent van de mensen die jonger dan 70 jaar waren bij overlijden hadden onderliggend lijden, waarvan cardiovasculaire aandoeningen en hypertensie, diabetes en chronische longaandoeningen het vaakst voorkwamen.[1] In veel gevallen verloopt COVID-19 mild en/of symptoomloos. Naast deze risicofactoren speelt het humane afweersysteem waarschijnlijk een belangrijke rol in het beloop van de ziekte, die door het SARS-CoV-2-virus wordt veroorzaakt.

Hoe het immuunsysteem de SARS-CoV-2-infectie precies bestrijdt en in hoeverre de respons adequaat is en langdurige bescherming biedt, is op dit moment nog niet duidelijk. Ook is nog onbekend wat de rol en het belang is van de aangeboren en verworven humorale (B-lymfocyten, antistoffen) en cellulaire (T-lymfocyten, cytokines) afweer. Daarom zijn wij een studie gestart om de immuunrespons bij mensen met verschillende ernst van COVID-19-ziekte in kaart te brengen. Daarnaast willen we inzicht krijgen in hoeverre de verworven humorale en cellulaire respons in de tijd aantoonbaar blijft. Mogelijk biedt dit aanknopingspunten om te beoordelen of deze respons bescherming biedt tegen herinfectie, en om de effectiviteit van een vaccin mede te kunnen beoordelen.

Interactie tussen B- en T-lymfocyten
Drainerende lymfeklieren vormen een ontmoetingsplek voor antigeenpresenterende cellen en B- en T-lymfocyten. De interactie tussen deze cellen maakt herkenning van lichaamsvreemde antigenen mogelijk en kan de aanzet vormen tot een afweerrespons tegen een nieuw coronavirus.
Elke B-lymfocyt heeft een unieke B-celreceptor, die door willekeurige genherschikking tot stand is gekomen. De B-celreceptoren herkennen zowel oplosbare antigenen als membraangebonden antigenen van micro-organismen en kunnen deze na internalisatie verwerken. Vervolgens komen peptidefragmenten van het antigeen terecht in het ‘major histocompatibility’-complex (MHC) klasse II-complex. B-lymfocyten zullen na de eerste herkenning van het antigeen IgM-antistoffen gaan produceren. Om vervolgens tot IgG-antistofproductie te worden aangezet, moeten de door de B-lymfocyten in het MHC klasse II-complex gepresenteerde antigenen worden herkend door specifieke receptoren op geactiveerde CD4+ T_helper-lymfocyten, ook aanwezig in de lymfeklieren. De interactie tussen de B- en T-lymfocyten wordt versterkt door co-stimulerende signalen, en vindt plaats in aanwezigheid van specifieke cytokines (onder meer interleukine (IL)-6 en IL-21). Dit stelt de B-lymfocyten in staat tot het maken van de isotypeswitch van IgM- naar IgG-antistoffen.[2] Daarnaast vindt affiniteitsrijping van de B-lymfocyten plaats, door selectie op grond van bindingssterkte van de B-celreceptor met het antigeen, en de vorming van geheugen-B-lymfocyten. De specifieke CD4+ T_helper-lymfocyten zijn tevens noodzakelijk voor het activeren van antigeenspecifieke CD8+- T_cytotoxische-lymfocyten die zorgen voor het opruimen van virusgeïnfecteerde cellen. De productie van interferon-gamma (IFN-gamma) door de geactiveerde T-lymfocyten is essentieel voor de effectiviteit van de afweerrespons tegen intracellulaire bacteriële en virale infecties.

Humorale afweer tegen SARS-CoV-2
Voor het stellen van de diagnose COVID-19 wordt meestal gebruikgemaakt van de detectie van SARS-CoV-2-RNA via real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Voor detectie van SARS-CoV-2-specifieke antistoffen zijn in korte tijd verschillende testmethoden beschikbaar gekomen. Deze maken gebruik van verschillende, specifieke SARS-CoV-2-antigenen (S1-domein van het spike-eiwit, combinatie S1/S2-domein, receptorbindend domein van het spike-eiwit, nucleocapside-eiwit) die op unieke wijze gekoppeld zijn aan verschillende soorten vaste dragers (cellulosestrip, gecoat op een plastic plaat, gebonden aan beads). Verschillende substraatreacties worden gebruikt om de binding van antistoffen aan te tonen. Testen gebaseerd op het principe van laterale flow immuno assay (LFIA) en enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) kwamen het eerst op de markt, gevolgd door onder meer chemoluminiscentie immuno assay (CLIA)-testen op geautomatiseerde systemen.
Inmiddels zijn diverse wetenschappelijke publicaties verschenen waarin serologische testen met elkaar worden vergeleken, en waarin de sensitiviteit van deze testen ten opzichte van PCR-bewezen ziekte en ernst van de ziekte en de specificiteit ten opzichte van andere coronavirussen zijn vastgesteld. Bovendien is er steeds meer inzicht in de correlatie tussen serologische routinetesten en de aanwezigheid van functionele antistoffen zoals neutraliserende antistoffen.[3] De testspecificaties zijn verschillend, afhankelijk van de ziekteduur en de ernst van de ziekte. Dit hangt ook samen met het type immunoglobuline dat wordt aangetoond, IgM, IgA, IgG of totaal-Ig-antistoffen. Globaal blijken SARS-CoV-2-antistoffen tussen 7 en 14 dagen na begin van de ziektesymptomen aantoonbaar. Naarmate het aantal ziektedagen langer en de ziekte ernstiger is, nadert de sensitiviteit van de meeste laboratorium IgG-testen de 95 procent of hoger. In Nederland verzamelt en deelt de Taskforce Serologie validatiedata, die worden aangeleverd door deelnemende medisch-microbiologische laboratoria. De rapportage van deze data is vrij toegankelijk en regelmatig worden geactualiseerde versies uitgebracht.[4]

Cellulaire afweer tegen SARS-CoV-2
Over de verworven cellulaire T-celrespons gericht tegen SARS-CoV-2-eiwitten is nog weinig bekend. Verschillende studies suggereren een onderdrukte T-celimmuniteit bij patiënten met ernstige COVID-19, gebaseerd op een verlaagd absoluut aantal circulerende T-lymfocyten of afwijkende IFN-gammaexpressie door T-lymfocyten gemeten met behulp van flowcytometrie.[5,6]
Zeer recent is een studie verschenen waarin SARS-CoV-2-eiwitpools zijn ingezet om te ontdekken welke SARS-CoV-2-eiwitten door specifieke T-lymfocyten van COVID-19-patiënten worden herkend, wederom gemeten met behulp van flowcytometrie. De resultaten lieten zien dat SARS-CoV-2-membraan-, spike- en nucleocapside-eiwitten codominant waren in herkenning door CD4+ T_helper-lymfocyten. Bij CD8+ T_cytotoxische-lymfocyten was de reactie tegen het spike-eiwit minder dominant en werd significante reactiviteit aangetoond tegen membraan-, nucleocapside- en andere SARS-CoV-2-eiwitten.[7] In een andere recente studie werd aangetoond dat CD4+ T_helper-lymfocyten van COVID-19-patiënten reageren met het SARS-CoV-2-spike-eiwit maar dat deze ook aantoonbaar waren bij SARS-CoV-2-seronegatieve gezonde donoren.[8] In beide artikelen wordt gediscussieerd over de samenhang tussen aangetoonde T-celreactiviteit en gemeten antistoffen tegen het SARS-CoV-2-spike-eiwit en de mogelijke kruisreactiviteit met andere coronavirussen.
Een andere methode om de functionele T-celrespons tegen SARS-CoV-2-antigenen te bepalen is het meten van IFN-gammaproductie met behulp van een enzyme-linked immunospot (ELISpot)-methode. In het laboratorium van de medische microbiologie van het Diakonessenhuis is een ELISpot ontwikkeld voor het meten van T-celreactiviteit tegen SARS-CoV-2- nucleocapside-antigenen en tegen een SARS-CoV-2-mozaïekproteïne, dat bestaat uit membraan-, nucleocapside- en spike-eiwitten (figuur 1).

De methode bestaat uit het isoleren van mononucleaire cellen uit het perifere bloed (peripheral blood monocuclear cells (PBMC’s)) en het toevoegen van een bepaald aantal cellen in een well van een plaat die is gecoat met IFN-gamma-vangende antistoffen. De cellen worden gestimuleerd met een bepaalde concentratie SARS-CoV-2-specifieke antigenen, met medium als negatieve controle en een polyklonale activator als positieve controle (anti-humaan CD3-monoklonale antistof). Indien de antigenen worden herkend door de antigeenspecifieke T-lymfocyten zullen ze IFN-gamma uitscheiden dat kan worden gevangen door de anti-IFN-gamma-antistoffen gecoat op de plaat. Na 16 tot 20 uur stimulatie wordt het gebonden IFN-gamma gedetecteerd met behulp van een chromogeen substraat waardoor een gekleurde ‘spot’ ontstaat rond IFN-gammaproducerende SARS-CoV-2-specifieke T-lymfocyten. Een groot voordeel van deze test is dat het relatief eenvoudig is om spotvormende units te kwantificeren.

SARS-CoV-2-immuunresponsstudie (SIR-studie)
Een recent in het Journal of Infection gepubliceerde studie, uitgevoerd in het Diakonessenhuis, toonde een robuuste T-celrespons tegen SARS-CoV-2-nucleocapside-eiwit meetbaar met behulp van de ELISpot test na circa 10 ziektedagen bij COVID-19-patiënten opgenomen op de intensive care (IC) of op de longafdeling (n = 27) (figuur 2a). In een gezonde controlegroep (n = 16) waren nooit meer dan negen spots meetbaar. Tien of meer spots tegen SARS-CoV-2-nucleocapside-eiwit werd dan ook beschouwd als diagnostisch voor COVID-19 (figuur 2b). Opvallend genoeg toonde een subset van de COVID-19-patiënten een vertraagde of onderdrukte respons. Vijf patiënten toonden vrijwel geen respons en vier toonden een zwakke T-celrespons, aantoonbaar na 18 tot 32 ziektedagen.[9] De patiënten met de vertraagde of onderdrukte respons waren niet significant lymfopener, terwijl de respons op de positieve controle (polyklonale activator) wel significant lager was dan bij de COVID-19-patiënten zonder vertraagde of onderdrukte respons. Dit laatste zou kunnen wijzen op een vorm van uitputting van de T-lymfocyten.[10] In hoeverre dit correleert met ziekteduur en ernst moet uit nader onderzoek blijken.

In samenwerking met het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) zal in een vervolgstudie de waarde van de SARS-CoV-2-ELISpot verder worden onderzocht. In de SARS-CoV-2-immuunresponsstudie (SIR-studie) zullen COVID-19-patiënten worden vergeleken met gezonde deelnemers. COVID-19-patiënten worden een jaar gevolgd, en op vijf momenten gedurende het jaar zullen niet alleen SARS-CoV-2- (virusneutraliserende) antistoffen maar ook de functionele T-celrespons met de SARS-CoV-2-ELISpot worden bepaald en gekwantificeerd. Hiermee hopen we inzicht te krijgen in de ontwikkeling van de immuunrespons tegen SARS-CoV-2 bij patiënten met ernstige, matige en milde COVID-19. Met name in deze laatste groep zijn er aanwijzingen dat de humorale respons afwezig of vertraagd is en lijkt de virusneutraliserende capaciteit van het serum beperkt.[11] Het is echter opvallend dat in een Zweedse en een Franse studie (de laatste als preprint beschikbaar op internet) ook na langere tijd SARS-CoV-2-specifieke T-lymfocyten zijn gemeten bij seronegatieve familieleden van COVID-19-patiënten en bij individuen die asymptomatische of milde COVID-19 hebben doorgemaakt. Bij een deel van niet aan SARS-CoV-2 blootgestelde individuen uit de controlegroep bleken SARS-CoV-2-specifieke T-lymfocyten aantoonbaar specifiek voor het membraan en spike-eiwit, maar niet gericht tegen het nucleocapside-eiwit.[12,13] In een Singaporese studie werd echter aangetoond dat bij patiënten die hersteld waren van SARS of COVID-19, de specifieke T-lymfocyten juist gericht waren tegen het SARS-CoV-2- nucleocapside-eiwit. Bij hen waren er nauwelijks T-lymfocyten detecteerbaar die gericht waren tegen niet-structurele eiwitten (NSP), gecodeerd door ORF1-regio. In tegenstelling tot deze bevindingen bij herstelde patiënten, bleek bij donoren die niet aan SARS-CoV of SARS-CoV-2 waren blootgesteld, de specifieke T-celrespons voornamelijk gericht te zijn tegen niet-structurele eiwitten van SARS-CoV-2. Omdat de ORF1-regio van SARS-CoV, SARS-CoV-2 en andere dierlijke bètacoronavirussen vrijwel volledige homologie vertoont, leidt blootstelling aan dierlijke coronavirussen waarschijnlijk tot priming van deze T-lymfocyten. Dit is een mogelijke verklaring voor de aangetoonde kruisreactiviteit. In hoeverre kruisreactie van eventueel al aanwezige specifieke T-lymfocyten tegen het nucleocapside-eiwit of de NSP-ORF1-eiwitten van invloed zijn op SARS-CoV-2-infectie of COVID-19-ziektebeloop zal onderzoek moeten uitwijzen.[14] Er zijn al overzichtsartikelen verschenen van de gepubliceerde studies waarin SARS-CoV-2-specifieke T-cel-responsen zijn geanalyseerd.[15,16]
De hierboven beschreven data laten zien dat blootstelling aan SARS-CoV-2 een virusspecifieke T-celrespons kan induceren met of zonder aantoonbare seroconversie. Detectie van SARS-CoV-2-specifieke T-lymfocyten in monsters van voor de COVID-19-pandemie (niet blootgesteld aan SARS-CoV of SARS-CoV-2) wijst mogelijk op kruisreactiviteit ten gevolge van blootstelling aan gewone humane verkoudheidscoronavirussen (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 en HCoV-229E) en/of dierlijke coronavirussen. T-celreactiviteit tegen het SARS-CoV-2-nucleocapside-eiwit wordt bij individuen die niet zijn blootgesteld aan SARS-CoV of SARS-CoV-2, in de verschillende studies niet of minder dominant aangetoond.
De in het Diakonessenhuis ontwikkelde SARS-CoV-2-ELISpot biedt dus mogelijk aanvullende diagnostische waarde voor het bepalen van blootstelling aan en de immuunstatus tegen SARS-CoV-2. Of de aanwezigheid van een duurzame specifieke T-celrespons met of zonder antistoffen bescherming biedt tegen herinfectie met SARS-CoV-2 zal vervolgonderzoek moeten uitwijzen.

12 oktober 2020 - H. Aardema
Prevention and treatment of infections
in intensive care patients - challenges and
potential improvements

Promotoren: prof. dr. A.M.G.A. de Smet
en prof. dr. J.G. Zijlstra
Copromotoren: dr. ir. H.J.M. Harmsen
en dr. W. Bult
UMCG Groningen,
afd. Intensive Care Volwassenen.
UMC Utrecht, Divisie Vitale functies

4 november 2020 -
Margarita Bernal Cabas
Bacterial protein secretion: applications & stress

Promotor: prof. dr. J.M. van Dijl
Co-promotor:  dr. G. Buist
UMC Groningen, afd. Medische Microbiologie
en Infectiepreventie

11 november 2020 -
B.C.G.C. Slingerland
Golden Staph, colonization, carriage
and transmission

Promotor: prof. dr. M.C. Vos
Copromotor: dr. W.J.B. van Wamel
Erasmus MC Rotterdam,
afd. Medische Microbiologie & Infectieziekten

16 november 2020 - 
Y. Mora-Hernandez
Exploring the Staphylococcus aureus cell wall for invariant immunodominant targets 

Promotor: prof. dr. J.M. van Dijl
Copromotor: dr. G. Buist
UMC Groningen, afd. Medische Microbiologie
en Infectiepreventie

25 november 2020 - B. Prajapati
Snap shots of bacterial adaptation

Promotoren: prof. dr. J.M. van Dijl
en prof. dr. A.W. Friedrich
UMC Groningen, afd. Medische Microbiologie
en Infectiepreventie

​                                   

27 november 2020 - Y.R. Saharman
ICU-acquired carbapenem non-susceptible bacilli in Indonesia

Promotor: prof. dr. H.A. Verbrugh (em.)
Copromotoren: dr. J.A. Severin
en dr. A. Karuniawati
Erasmus MC Rotterdam,
afd. Medische Microbiologie & Infectieziekten

2 december 2020 - R.Y. Yahiaoui
Streptococcus pneumoniae carriage
and effect of vaccination on prevalence,
serotypes and antibiotic resistance

Promotor: prof. dr. A. Verbon
Copromotor: dr. E.E. Stobberingh
Erasmus MC Rotterdam,
afd. Medische Microbiologie & Infectieziekten

9 december 2020 - R. Aguilar Suárez
Less is more: Genome-reduced Bacillus subtilis for protein production

Promotor: prof. dr. J.M. van Dijl
Copromotor: dr. G. Buist
UMC Groningen, afd. Medische Microbiologie
en Infectiepreventie